Identifizierung und Charakterisierung glialer Gene im embryonalen zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster

Im embryonalen Nervensystem von Drosophila wird gliales Schicksal durch den Transkriptionsfaktor gcm induziert. Es konnte gezeigt werden, daß die ektopische Expression von gcm im Nervensystem einen Überschuß an Gliazellen generiert, während Funktionsverlustmutanten von gcm nahezu keine Gliazellen mehr besitzen. Im Gegensatz zu der beschriebenen Funktion von gcm als binäres Schaltergen zwischen neuronalem und glialem Schicksal, gibt es nur wenig Hinweise auf Mechanismen zur weiteren Spezifizierung und Differenzierung der verschiedenen glialen Subtypen und den daran beteiligten Genen. Die vorliegende Arbeit beschreibt die auf Microarray-Experimenten basierende Genom-weite Suche nach neuen gcm-abhängigen glialen Genen. Diese Analyse vergleicht die ektopische Expression von gcm im gesamten Nervensystem und zum ersten Mal die gcm Funktionsverlustmutante mit dem Wildtyp. Beide Ansätze wurden als Zeitverlaufsexperimente durchgeführt, die den Zeitraum der Gliogenese in Drosophila umfassen. Im Vorfeld durchgeführte Kontrollexperimente ermöglichten die Bestimmung des methodischen und genetischen Hintergrundrauschens, die eine Reduktion von "falsch positiven" Genen ermöglichte und die Sensitivität der Microarray-Auswertung erhöhte. Durch manuelle Filterschritte wurde der Schwerpunkt der Daten-Interpretation eher auf biologische Aspekte als auf eine rein statistische Auswertung gelegt und dies brachte deutlich Vorteile in der Auswahl der potentiellen Zielgene. Insbesondere die Analyse der temporalen Expressionsprofile, der Vergleich der antagonistischen Ansätze sowie eine ausführliche Recherche der vorhandenen Datenbanken im Hinblick auf bekannte Expression und Funktion der differentiell regulierten Gene, ermöglichten die Identifizierung von etwa 400 potentiellen Zielgenen. Für mehr als 30% dieser Gene konnte Expression in den gcm-abhängigen Gliazellen, hämatopoetischen Zellen oder den "tendon cells" nachgewiesen werden. Hierunter befinden sich mehr als 50 Gene, deren Abhängigkeit von gcm bisher nicht bekannt war. Eine zelluläre Analyse ausgewählter Kandidatengene auf Einzelzellebene, ihre Abhängigkeit von gcm sowie eine regulatorische Analyse in verschiedenen mutanten Hintergründen bekannter glialer Gene, geben Einblick in die verschiedenen Mechanismen glialer Regulation. An einigen Beispielen wird eine mögliche Funktion der aus dieser Analyse hervorgegangen Gene in den bekannten Kontext glialer Differenzierung und Funktion für Drosophila diskutiert.

Einfluss der Habitatfragmentierung durch Überflutung auf Laufkäferpopulationen (Coleoptera; Carabidae)

Innerhalb dieser Dissertation wurde zwischen den Jahren 2002 und 2005 mit Hilfe von Barberfallen die Laufkäferfauna der Auwälder am nördlichen Oberrhein zwischen Mainz und Bingen erfasst. Dabei dienten verschiedene Rheininseln und ufernahe Festlandgebiete als Probeflächen. Fünf der typischen Bewohner dieser Flächen (Agonum afrum, Nebria brevicollis, Oxypselaphus obscurus, Platynus assimilis, Pterostichus anthracinus) dienten weiterhin als Modellarten für die Untersuchung der genetischen Diversität zwischen den einzelnen Populationen mittels RAPD-Analysen. Alles in allem konnten im Untersuchungsgebiet über 20.000 Individuen aus 101 Carabidenarten gefangen werden. Die häufigsten Vertreter waren Platynus assimilis, Pterostichus melanarius und Agonum afrum. Hohe Diversitäts- und Dominanzindices auf allen Flächen sprechen für die Dynamik des Lebensraumes und somit die Intaktheit der untersuchten Auwälder. Einen weiteren Hinweis auf die ständig wechselnden Lebensbedingungen durch immer wiederkehrende Überflutungen zeigt das Auftreten verschiedener ökologischer Gruppen. Überall dominierten deutlich die Arten, die mit gewissen Störungen des Habitates auskommen oder durch ihr hohes Ausbreitungspotential davor fliehen können. Das sind die Imaginalüberwinterer, makropteren, hygrophilen und kleinen Spezies. Auch das Geschlechterverhältnis weist auf deutliche Anzeichen für regelmäßige Beeinträchtigungen der Flächen hin. Knapp die Hälfte der beobachteten Arten im Untersuchungsgebiet steht auf einer der Roten Listen von Deutschland, Rheinland-Pfalz oder Hessen. Somit besteht für das gesamte Gebiet ein hoher Schutzbedarf. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit lag bei den Einflüssen der Hochwasserstände auf die Artenzusammensetzungen und die genetischen Diversitäten der Laufkäferpopulationen. Deshalb untersuchte man auch die Wirkung derjenigen Faktoren, die ihrerseits unmittelbar von den Extremwasserständen beeinflusst werden. Hier sind vor allem der Auentyp (Weichholz/Hartholz) und die Lage der Flächen auf Insel oder Festland zu nennen, die die deutlichsten Unterschiede in Artendiversität und Genetik der einzelnen Populationen zeigten. Aber auch weitere Faktoren, wie Wasserstandsdynamik, Auwaldbreite, Entfernung vom Fluss und Lage zum Damm weisen Zusammenhänge mit bestimmten ökologischen Gruppen auf. Lediglich die Habitatgröße scheint keinen Einfluss auf die Diversitäten zu nehmen. Abschließend konnten auch für das Jahr 2003, in dem extrem heiße und trockene Bedingungen herrschten, negative Effekte auf die Laufkäfergemeinschaften gezeigt werden.

Genetische Varianten synaptischer Proteine als Risikomechanismus der Alkoholabhängigkeitund Alkohol-bezogener Phänotypen

Die Alkoholabhängigkeit gehört zu den häufigen chronischen Erkrankungen, welche mit einem vorzeitigen Verlust von Gesundheit und Lebensqualität einhergeht. Familien- und Zwillingsuntersuchungen sprechen dafür, dass mehr als 50% der Verhaltensvarianz durch genetische Faktoren zu erklären ist. In der vorliegenden kumulativen Habilitationsarbeit wurden verhaltensgenetische, molekularbiologische, humangenetische und funktionell bildgebende Untersuchungstechniken kombiniert, um ein erweitertes Verständnis der Neurobiologie der Alkoholabhängigkeit zu erzielen. In einer Serie tierexperimenteller Arbeiten konnte u.a. nachgewiesen werden, dass das Gen für das Multiple PDZ Domänen Protein Mpdz ein Kandidatengen des Alkoholentzugs, Barbituratentzugs und der neuronalen Exzitabilität darstellt. In zwei weiteren Untersuchungen wurden Kandidatengene der Alkoholpräferenz untersucht. Hier konnte mit dem Syntaxin binding protein 1 (Stxbp1) ein Kandidatengen der Alkoholpräferenz bestätigt werden. Humangenetische Untersuchungen sprechen dafür, dass molekulare Varianten in der Alpha2 Untereinheit des GABAA Rezeptors zu einem erhöhten Risiko der Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beim Menschen beitragen. Mit einer 18F-Fluorodesoxyglucose Untersuchung konnte nachgewiesen werden, dass Alkohol in vivo das mesolimbische Rewardsystem stimuliert, diese Stimulation jedoch nicht durch Tiagabin, einem GABA-Transporterinhibitor, hemmbar ist. Zusammengefasst sprechen die Untersuchungen dafür, dass molekulare Varianten synaptischer Proteine zu einer veränderten Alkoholempfindlichkeit und dem Risiko zur Entwicklung einer Alkoholabhängigkeit beitragen.

Strukturbildung durch Selbstorganisation von Oligonukleotiden

Die DNA-Doppelhelix ist eine relativ dicke (Ø ≈ 2 nm), kompakte und dadurch auf kurzen Längenskalen relativ steife Verbindung (lp[dsDNA] ≈ 50-60 nm), mit einer klar definierten Struktur, die durch biologische Methoden sehr präzise manipuliert werden kann. Die Auswirkungen der primären Sequenz auf die dreidimensionale Strukturbildung ist gut verstanden und exakt vorhersagbar. Des Weiteren kann DNA an verschiedenen Stellen mit anderen Molekülen verknüpft werden, ohne dass ihre Selbsterkennung gestört wird. Durch die helikale Struktur besteht außerdem ein Zusammenhang zwischen der Lage und der räumlichen Orientierung von eingeführten Modifikationen. Durch moderne Syntheseverfahren lassen sich beliebige Oligonukleotidsequenzen im Bereich bis etwa 150-200 Basen relativ preiswert im Milligrammmaßstab herstellen. Diese Eigenschaften machen die DNA zu einem idealen Kandidaten zur Erzeugung komplexer Strukturen, die durch Selbsterkennung der entsprechenden Sequenzen gebildet werden. In der hier vorgelegten Arbeit wurden einzelsträngige DNA-Abschnitte (ssDNA) als adressierbare Verknüpfungsstellen eingesetzt, um verschiedene molekulare Bausteine zu diskreten nicht periodischen Strukturen zu verbinden. Als Bausteine dienten flexible synthetische Polymerblöcke und semiflexible Doppelstrang-DNA-Abschnitte (dsDNA), die an beiden Enden mit unterschiedlichen Oligonukleotidsequenzen „funktionalisiert“ sind. Die zur Verknüpfung genutzten Oligonukleotidabschnitte wurden so gewählt (n > 20 Basen), dass ihre Hybridisierung zu einer bei Raumtemperatur stabilen Doppelstrangbildung führt. Durch Kombination der Phosphoramiditsynthese von DNA mit einer festkörpergestützten Blockkopplungsreaktion konnte am Beispiel von Polyethylenoxiden ein sehr effektiver Syntheseweg zur Herstellung von ssDNA1-PEO-ssDNA2-Triblockcopolymeren entwickelt werden, der sich problemlos auf andere Polymere übertragen lassen sollte. Die Längen und Basenabfolgen der beiden Oligonukleotidsequenzen können dabei unabhängig voneinander frei gewählt werden. Somit wurden die Voraussetzungen geschaffen, um die Selbsterkennung von Oligonukleotiden durch Kombination verschiedener Triblockcopolymere zur Erzeugung von Multiblockcopolymeren zu nutzen, die mit klassischen Synthesetechniken nicht zugänglich sind. Semiflexible Strukturelemente lassen sich durch die Synthese von Doppelstrangfragmenten mit langen überstehenden Enden (sticky-ends) realisieren. Die klassischen Ansätze der molekularen Genetik zur Erzeugung von sticky-ends sind in diesem Fall nicht praktikabel, da sie zu Einschränkungen im Bezug auf Länge und Sequenz der überhängenden Enden führen. Als Methode der Wahl haben sich zwei verschiedene Varianten der Polymerase Kettenreaktion (PCR) erwiesen, die auf der Verwendung von teilkomplementären Primern beruhen. Die eigentlichen Primersequenzen wurden am 5´-Ende entweder über ein 2´-Desoxyuridin oder über einen kurzen Polyethylenoxid-Spacer (n = 6) mit einer frei wählbaren „sticky-end-Sequenz“ verknüpft. Mit diesen Methoden sind sowohl 3´- als auch 5´-Überhänge zugänglich und die Länge der Doppelstrangabschnitte kann über einen breiten Molmassenbereich sehr exakt eingestellt werden. Durch Kombination derartiger Doppelstrangfragmente mit den biosynthetischen Triblockcopolymeren lassen sich Strukturen erzeugen, die als Modellsysteme zur Untersuchung verschiedener Biomoleküle genutzt werden können, die in Form eines mehrfach gebrochenen Stäbchens vorliegen. Im letzten Abschnitt wurde gezeigt, dass durch geeignete Wahl der überstehenden Enden bzw. durch Hybridisierung der Doppelstrangfragmente mit passenden Oligonukleotiden verzweigte DNA-Strukturen mit Armlängen von einigen hundert Nanometern zugänglich sind. Im Vergleich zu den bisher veröffentlichten Methoden bietet diese Herangehensweise zwei entscheidende Vorteile: Zum einen konnte der Syntheseaufwand auf ein Minimum reduziert werden, zum anderen ist es auf diesem Weg möglich die Längen der einzelnen Arme, unabhängig voneinander, über einen breiten Molmassenbereich zu variieren.

Forensisch relevante SNP-Genotypisierung mittels elektronischer Microarray-Technologie

Die vorliegende Dissertation entstand im Rahmen eines multizentrischen EU-geförderten Projektes, das die Anwendungsmöglichkeiten von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) zur Individualisierung von Personen im Kontext der Zuordnung von biologischen Tatortspuren oder auch bei der Identifizierung unbekannter Toter behandelt. Die übergeordnete Zielsetzung des Projektes bestand darin, hochauflösende Genotypisierungsmethoden zu etablieren und zu validieren, die mit hoher Genauigkeit aber geringen Aufwand SNPs im Multiplexformat simultan analysieren können. Zunächst wurden 29 Y-chromosomale und 52 autosomale SNPs unter der Anforderung ausgewählt, dass sie als Multiplex eine möglichst hohe Individualisierungschance aufweisen. Anschließend folgten die Validierungen beider Multiplex-Systeme und der SNaPshot™-Minisequenzierungsmethode in systematischen Studien unter Beteiligung aller Arbeitsgruppen des Projektes. Die validierte Referenzmethode auf der Basis einer Minisequenzierung diente einerseits für die kontrollierte Zusammenarbeit unterschiedlicher Laboratorien und andererseits als Grundlage für die Entwicklung eines Assays zur SNP-Genotypisierung mittels der elektronischen Microarray-Technologie in dieser Arbeit. Der eigenständige Hauptteil dieser Dissertation beschreibt unter Verwendung der zuvor validierten autosomalen SNPs die Neuentwicklung und Validierung eines Hybridisierungsassays für die elektronische Microarray-Plattform der Firma Nanogen Dazu wurden im Vorfeld drei verschiedene Assays etabliert, die sich im Funktionsprinzip auf dem Microarray unterscheiden. Davon wurde leistungsorientiert das Capture down-Assay zur Weiterentwicklung ausgewählt. Nach zahlreichen Optimierungsmaßnahmen hinsichtlich PCR-Produktbehandlung, gerätespezifischer Abläufe und analysespezifischer Oligonukleotiddesigns stand das Capture down-Assay zur simultanen Typisierung von drei Individuen mit je 32 SNPs auf einem Microarray bereit. Anschließend wurde dieses Verfahren anhand von 40 DNA-Proben mit bekannten Genotypen für die 32 SNPs validiert und durch parallele SNaPshot™-Typisierung die Genauigkeit bestimmt. Das Ergebnis beweist nicht nur die Eignung des validierten Analyseassays und der elektronischen Microarray-Technologie für bestimmte Fragestellungen, sondern zeigt auch deren Vorteile in Bezug auf Schnelligkeit, Flexibilität und Effizienz. Die Automatisierung, welche die räumliche Anordnung der zu untersuchenden Fragmente unmittelbar vor der Analyse ermöglicht, reduziert unnötige Arbeitsschritte und damit die Fehlerhäufigkeit und Kontaminationsgefahr bei verbesserter Zeiteffizienz. Mit einer maximal erreichten Genauigkeit von 94% kann die Zuverlässigkeit der in der forensischen Genetik aktuell eingesetzten STR-Systeme jedoch noch nicht erreicht werden. Die Rolle des neuen Verfahrens wird damit nicht in einer Ablösung der etablierten Methoden, sondern in einer Ergänzung zur Lösung spezieller Probleme wie z.B. der Untersuchung stark degradierter DNA-Spuren zu finden sein.

Early steps in ventral nerve cord development in chelicerates and myriapods and formation of brain compartments in spiders

The central point of this work is the investigation of neurogenesis in chelicerates and myriapods. By comparing decisive mechanisms in neurogenesis in the four arthropod groups (Chelicerata, Crustacea, Insecta, Myriapoda) I was able to show which of these mechanisms are conserved and which developmental modules have diverged. Thereby two processes of embryonic development of the central nervous system were brought into focus. On the one hand I studied early neurogenesis in the ventral nerve cord of the spiders Cupiennius salei and Achaearanea tepidariorum and the millipede Glomeris marginata and on the other hand the development of the brain in Cupiennius salei.rnWhile the nervous system of insects and crustaceans is formed by the progeny of single neural stem cells (neuroblasts), in chelicerates and myriapods whole groups of cells adopt the neural cell fate and give rise to the ventral nerve cord after their invagination. The detailed comparison of the positions and the number of the neural precursor groups within the neuromeres in chelicerates and myriapods showed that the pattern is almost identical which suggests that the neural precursors groups in these arthropod groups are homologous. This pattern is also very similar to the neuroblast pattern in insects. This raises the question if the mechanisms that confer regional identity to the neural precursors is conserved in arthropods although the mode of neural precursor formation is different. The analysis of the functions and expression patterns of genes which are known to be involved in this mechanism in Drosophila melanogaster showed that neural patterning is highly conserved in arthropods. But I also discovered differences in early neurogenesis which reflect modifications and adaptations in the development of the nervous systems in the different arthropod groups.rnThe embryonic development of the brain in chelicerates which was investigated for the first time in this work shows similarities but also some modifications to insects. In vertebrates and arthropods the adult brain is composed of distinct centres with different functions. Investigating how these centres, which are organised in smaller compartments, develop during embryogenesis was part of this work. By tracing the morphogenetic movements and analysing marker gene expressions I could show the formation of the visual brain centres from the single-layered precheliceral neuroectoderm. The optic ganglia, the mushroom bodies and the arcuate body (central body) are formed by large invaginations in the peripheral precheliceral neuroectoderm. This epithelium itself contains neural precursor groups which are assigned to the respective centres and thereby build the three-dimensional optical centres. The single neural precursor groups are distinguishable during this process leading to the assumption that they carry positional information which might subdivide the individual brain centres into smaller functional compartments.rn

Impact of anthropogenic stressors on the population genetics of the common bioindicator Dreissena polymorpha (Pallas, 1771)

Toxicant inputs from agriculture, industry and human settlements have been shown to severely affect freshwater ecosystems. Pollution can lead to changes in population genetic patterns through various genetic and stochastic processes. In my thesis, I investigated the impact of anthropogenic stressors on the population genetics of the zebra mussel Dreissena polymorpha. In order to analyze the genetics of zebra mussel populations, I isolated five new highly polymorphic microsatellite loci. Out of those and other already existing microsatellite markers for this species, I established a robust marker set of six microsatellite loci for D. polymorpha. rnMonitoring the biogeographical background is an important requirement when integrating population genetic measures into ecotoxicological studies. I analyzed the biogeographical background of eleven populations in a section of the River Danube (in Hungary and Croatia) and some of its tributaries, and another population in the River Rhine as genetic outgroup. Moreover, I measured abiotic water parameters at the sampling sites and analyzed if they were correlated with the genetic parameters of the populations. The genetic differentiation was basically consistent with the overall biogeographical history of the populations in the study region. However, the genetic diversity of the populations was not influenced by the geographical distance between the populations, but by the environmental factors oxygen and temperature and also by other unidentified factors. I found strong evidence that genetic adaptation of zebra mussel populations to local habitat conditions had influenced the genetic constitution of the populations. Moreover, by establishing the biogeographical baseline of molecular variance in the study area, I laid the foundation for interpreting population genetic results in ecotoxicological experiments in this region.rnIn a cooperation project with the Department of Zoology of the University of Zagreb, I elaborated an integrated approach in biomonitoring with D. polymorpha by combining the analysis techniques of microsatellite analysis, Comet assay and micronucleus test (MNT). This approach was applied in a case study on freshwater contamination by an effluent of a wastewater treatment plant (WWTP) in the River Drava (Croatia) and a complementary laboratory experiment. I assessed and compared the genetic status of two zebra mussel populations from a contaminated and a reference site. Microsatellite analysis suggested that the contaminated population had undergone a genetic bottleneck, caused by random genetic drift and selection, whereas a bottleneck was not detected in the reference population. The Comet assay did not indicate any difference in DNA damage between the two populations, but MNT revealed that the contaminated population had an increased percentage of micronuclei in hemocytes in comparison to the reference population. The laboratory experiment with mussels exposed to municipal wastewater revealed that mussels from the contaminated site had a lower percentage of tail DNA and a higher percentage of micronuclei than the reference population. These differences between populations were probably caused by an overall decreased fitness of mussels from the contaminated site due to genetic drift and by an enhanced DNA repair mechanism due to adaptation to pollution in the source habitat. Overall, the combination of the three biomarkers provided sufficient information on the impact of both treated and non-treated municipal wastewater on the genetics of zebra mussels at different levels of biological organization.rnIn my thesis, I could show that the newly established marker set of six microsatellite loci provided reliable and informative data for population genetic analyses of D. polymorpha. The adaptation of the analyzed zebra mussel populations to the local conditions of their habitat had a strong influence on their genetic constitution. We found evidence that the different genetic constitutions of two populations had influenced the outcome of our ecotoxicological experiment. Overall, the integrated approach in biomonitoring gave comprehensive information about the impact of both treated and non-treated municipal wastewater on the genetics of zebra mussels at different levels of biological organization and was well practicable in a first case study.